Центр по проведению судебных экспертиз и исследований
автономная некоммерческая организация
«Судебный Эксперт»
Автономная некоммерческая организация
«Судебный Эксперт»

Генетическая экспертиза митохондриальной ДНК (мтДНК)

Генетическая информация определяет рост, развитие, строение, обмен веществ, психологический склад человека, а также предрасположенность к различным заболеваниям. Эта информация зашифрована в ДНК, которая представлена не только в ядре клетки, но и в органеллах (митохондриях), необходимых для превращения химической энергии из пищи в формы, необходимые клетке – это так называемая митохондриальная ДНК.

Митохондрии – это "энергетические станции" клетки, без которых она не сможет существовать. Митохондрии имеют собственную генетическую информацию, зашифрованную в митохондриальной ДНК. Когда-то митохондрии представляли собой бактерии. Но, попав в эукариотические клетки, они растеряли часть своей генетической информации, часть отдали в ядро клетки-хозяина, и сейчас митохондриальная ДНК состоит всего лишь из 37 генов, необходимых для окисления глюкозы до углекислого газа и воды и синтеза клеточного "топлива": АТФ (аденозинтрифосфат) и НАДН (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида).

Митохондриальная ДНК передается от матери ко всем ее детям, от дочерей к внукам. Почему же так происходит? Почему мы не можем унаследовать митохондриальную ДНК от отца?

Яйцеклетки (женские половые клетки) содержат огромное количество митохондрий, в сотни, а то и в тысячи раз больше, чем содержат сперматозоиды (мужские половые клетки), которым митохондрии необходимы в основном только для движения. При оплодотворении сперматозоид проникает в яйцеклетку, зачастую теряя свой жгутик и митохондрии, которые находятся в основании жгутика. Затем сперматозоид сливается с яйцеклеткой, происходит образование зиготы. Митохондрии сперматозоида, меченные убиквитинином, разрушаются ооцитом, и ядро сперматозоида сливается с ядром яйцеклетки (Рисунок 1), давая начало новой жизни.

Образование зиготы. Все клетки человека кроме половых клеток несут диплоидный набор хромосом (46 хромосом). В ядрах половых клеток находится гаплоидный набор хромосом (23 хромосомы). После слияния сперматозоида с яйцеклеткой образуется зигота, формируются мужской и женские нуклеусы (в них находится по 23 хромосомы), которые сближаются и  сливаются в ядро зиготы. С этого момента клетка становится диплоидной (несет двойной набор хромосом) и начинается деление клетки.
Рисунок 1. Образование зиготы. Все клетки человека, кроме половых, несут диплоидный набор хромосом (46 хромосом). В ядрах половых клеток находится гаплоидный набор хромосом (23 хромосомы). После слияния сперматозоида с яйцеклеткой образуется зигота, формируются мужской и женские нуклеусы (в них находится по 23 хромосомы), которые сближаются и сливаются в ядро зиготы. С этого момента клетка становится диплоидной (несет двойной набор хромосом), и начинается деление клетки.

Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. И мужчины, и женщины получают митохондрии из цитоплазмы материнской яйцеклетки. Эти маленькие двуспиральные цепочки ДНК тянутся к нам из далекого прошлого, со времен проматери "митохондриальной Евы", которая являлась общим предком всех ныне живущих людей по материнской линии. Если ядерную ДНК, которая представлена 46-ю хромосомами, ребенок наследует от обоих родителей (половину – 23 – от матери, половину от отца), то митохондрии и мтДНК ребенок получает только от матери (Рисунок 2). Именно поэтому митохондриальная ДНК является идеальным объектом для генетической экспертизы родственных связей по материнской линии. Но если в случае установления отцовства используются полиморфизмы длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ), то генетическая экспертиза митохондриальной ДНК представляет собой выявление индивидуальных точковых нуклеотидных изменений в ДНК митохондрий, их отождествление или дифференцировку. В митохондриальной ДНК гены очень плотно "упакованы". Несмотря на то что в мтДНК очень мало тандемных повторов, она буквально "напичкана" точковыми мутациями, что делает ее весьма вариабельной (это значит, что она совсем разная у людей, не имеющих общих предков по материнской линии). Именно эти мутации детектируют и анализируют с помощью секвенаторов нового поколения при исследовании митохондриальной ДНК.

Принцип наследования мтДНК. В виде разноцветных кругов показано различающиеся копии мтДНК.
Рисунок 2. Принцип наследования мтДНК. В виде разноцветных кругов показаны различающиеся копии мтДНК.

Митохондриальная ДНК обладает рядом особенностей, которые отличают ее от ядерной ДНК и позволяют использовать при генетической экспертизе:

  • мтДНК не подвержена рекомбинации, поэтому вся молекула изменяется только путем мутирования на протяжении тысячелетий;
  • данный тип ДНК наследуется только по материнской линии;
  • мтДНК можно выделить из любого биологического материала;
  • благодаря большому количеству копий мтДНК иногда может быть единственным источником ДНК - например, при сильно деградированной ядерной ДНК или недостаточности биологического материала;
  • высокий мутационный уровень мтДНК, по сравнению с одной копией ядерной ДНК, увеличивает идентификационный уровень генетической экспертизы.

В каких случаях необходимо проведение генетической экспертизы митохондриальной ДНК (мтДНК)?

  • для установления родственной связи между двумя женщинами или женщиной и мужчиной у предполагаемых родственников по материнской линии. Например, дед/бабка-внук, дядя/тетя-племянник, брат-сестра;
  • при исследовании крайне малого объема биологического материала. Количество копий мтДНК в одной клетке составляет 100-10 000, в то время как в ядерной ДНК всего лишь по две пары каждой из 23 хромосом;
  • при исследовании образцов десятилетней, столетней и даже тысячелетней давности. Так, например, по мтДНК удалось идентифицировать останки членов российской императорской семьи Романовых.
  • за неимением другого генетического материала. Например, при наличии всего лишь одного волоса. Ствол (стержень) волоса содержит незначительное количество ядерной ДНК, но является хорошим источником митохондриальной ДНК;
  • для определения принадлежности генетического профиля той или иной генеалогической ветви человечества (европейской гаплогруппе, африканской, ближневосточной, американской и т.д.). Таким образом, можно определить происхождение человека.

Какие материалы необходимо предоставить для проведения генетической экспертизы митохондриальной ДНК (мтДНК)?

Митохондриальная ДНК присутствует во всех клетках организма. Она находится даже в тех клетках организма, в которых отсутствует ядро (тромбоциты, эритроциты, клетки стержня волос и т.д.). Поэтому для получения мтДНК подходят любые ткани организма: кости, зубы, кровь, сперма, фрагменты скелетированных трупов, фрагменты частей тела и многое другое. Обычно, как и при генетической экспертизе по установлению отцовства или материнства, берутся образцы буккального эпителия (соскоб ватной палочкой с внутренней стороны щеки), кровь из пальца в объеме 0,3-0,5 мл, кровь на ватном диске, волосы или ногти. Взятие образцов тканей осуществляется в соответствии со следующими законами:

  • ст. 35 Федерального закона от 31 мая 2001 г. №73-ФЗ "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации";
  • п. 84.4 "Порядок организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации" (Приказ Минздравсоцразвития РФ №346н от 12.05.2010 г.).

Эксперты-генетики после получения биологического материала направляются в специализированную лабораторию, где полученный биоматериал последовательно проходит три этапа исследования: 1) выделение мтДНК; 2) амплифицирование (многократное умножение) определенного локуса мтДНК; 3) определение первичной последовательности нуклеотидов амплифицированного локуса.

На первом этапе эксперт производит выделение ДНК из полученного материала. Выделение митохондриальной ДНК из клеток является очень сложным процессом и в некоторых случаях может продлиться 24 часа. Например, весь процесс выделения митохондриальной ДНК из крови составляет около двух часов, в то время как для того, чтобы только лизировать (разрушить) ткань волоса или ногтя, приходится обрабатывать ее соответствующим ферментом около 12 часов. В большинстве случаев для этих целей используются коммерческие наборы реактивов ведущих зарубежных фирм-производителей, таких как Applied Biosystems (США), Promega (США), QIAGEN (Германия).

На втором этапе анализа производят полимеразно-цепную реакцию (ПЦР-реакцию), в результате которой определенный участок мтДНК (D-петля, или так называемая петля смещения) многократно увеличивается. Именно анализ нуклеотидной последовательности D-петли является дифференцирующим признаком при исследовании мтДНК. Высокий уровень вариабельности D-петли обусловлен тем, что у разных людей этот участок может иметь разную первичную последовательность нуклеотидов (так называемых "кирпичиков", из которых построена ДНК). В популяции обнаруживается целый набор вариантов, отличающихся друг от друга наличием различных мутаций: точковых нуклеотидных замен, микроделеций и микроинсерций. У каждого индивидуума в популяции имеется в норме только один такой вариант, который этот индивидуум унаследовал по своей материнской линии. Как следствие, полинуклеотидная D-петля обладает свойством индивидуальной специфичности.

На следующем этапе производят очистку амплифицированного участка митохондриальной ДНК и его секвенирование. Секвенирование – это определение первичной последовательности ДНК, иными словами - расшифровка генетического кода, который в принципе уникален для каждого организма. Сравнивая нуклеотидные последовательности D-петли из разных образцов, эксперт устанавливает степень их соответствия друг другу, а также сравнивает их с референсной последовательностью мтДНК. Расчет несовпадения нуклеотидов (мутаций) ДНК осуществляется согласно ст. 3.6 Методических указаний Минздрава РФ №2001/4 от 25.01.2001 г. "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления биологического родства". В выводах генетической экспертизы митохондриальной ДНК указывается вероятность совпадения признаков, выраженная в процентах.

Все результаты тестирования мтДНК сравнивают с так называемой "стандартной кембриджской последовательностью". Это первая нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК, которая была расшифрована. Данная работа была выполнена в 1981 году в Кембридже Стеном Андерсеном, за что последовательность мтДНК получила второе название - "последовательность Андерсена" (в англоязычной литературе). Поскольку это была первая последовательность мтДНК, ее и взяли за международный стандарт. В настоящее время все мутации в анализируемой последовательности отсчитывают от нее. Сравнивая нуклеотидную последовательность исследуемой мтДНК со стандартной кембриджской последовательностью, устанавливают генетический профиль исследуемой мтДНК, то есть дают ему индивидуальную генетическую характеристику.

По генетическому профилю устанавливают, к какой расе или гаплогруппе относится исследуемая митохондриальная ДНК (и соответственно человек, которому она принадлежит). Следовательно, генетическая экспертиза митохондриальной ДНК позволяет построить ДНК-генеалогию и в определенных случаях предвидеть внешность разыскиваемого человека. Если по Y-хромосоме ученые пытаются найти предполагаемого Адама, то по генетическому профилю мтДНК можно найти предполагаемую Еву.

Генетическая экспертиза митохондриальной ДНК отвечает на два главных вопроса:

  1. Имеются ли совпадения нуклеотидных последовательностей мтДНК у анализируемых биологических образцов? Для этого по определенным правилам сопоставляют полученные индивидуальные профили полиморфизма анализируемых фрагментов ДНК с целью их отождествления или выявления сходства и различий и установления на этом основании определенных фактов, которые могут иметь доказательственное значение по делу.
  2. Если совпадение признаков установлено, то какова вероятность того, что это совпадение закономерно, а не является случайностью?

Нормативно-правовые документы, определяющие порядок проведения в Российской Федерации генетической экспертизы митохондриальной ДНК:

  • Федеральный закон от 31 мая 2001 г. №73-ФЗ "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации";
  • Приказ Минздравсоцразвития РФ №346н от 12.05.2010 г. "Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз";
  • Методические указания Минздрава РФ №2001/4 от 25.01.2001 г. "Применение молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления биологического родства";
  • Семейный кодекс РФ. Глава 10 "Установление происхождения детей".

Стоимость и сроки

Эксперты

Обращаем ваше внимание на то, что перечень экспертов, представленный на сайте, не является полным списком наших специалистов, а составляет лишь некоторую его часть. Для получения информации о подробном перечне доступных экспертов свяжитесь с нами

Чаcтые вопросы

У вас остались вопросы?
Свяжитесь с нами, и мы вам поможем!